Identifikasi Subtipe Virus Avian Influenza Isolat Legok Menggunakan Polymerase Chain Reaction

PUDJIATMOKO, BAHRUDDIN SYAHRONI HASIBUAN, SRI MURNI ASTUTI, EMILIA DAN ENUH RAHARJO JUSA

Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan

(National Veterinary Drug Assay Laboratory), Gunungsindur, Bogar 16340, Indonesia

ABSTRACT

The virology laboratory of Veterinary Drug Assay Laboratory isolated a virus which caused respiratory clinical signs in chicken from a layer farm, in Legok, Tangerang. The clinical signs of the disease were very similar to the avian influenza. The virus isolate was then identified by RT-PCR using Primer NP-1200f and NP-1529r that amplified nucleoprotein gene of all influenza virus of poultry, man, pig and horse, and using 15 pair of HI­-15 primer that amplified haemagglutinin antigen (HA) of avian subtype. The result of RT-PCR showed that both of the genes of Legok isolate were amplified with NP-1200f and NP-1529r pair and H5-131f and H5-580r pair primers. The result indicated that the Legok isolate was an avian influenza subtype H5Nl.

Key word: Avian influenza, RT-PCR, Nucleoprotein, hemagglutinin, Legok isolate.

ABSTRAK

Laboratorium virologi Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan telah mengisolasi virus avian influenza yang berasal dari ayam dengan gejala klinis kelainan saluran pernafasan, dari peternakan ayam layer di Legok, Tangerang. Gejala penyakit yang ditimbulkan menyerupai penyakit avian influenza. Isolat virus diidentifikasi menggunakan RT-PCR dengan sepasang primer NP-1200f dan NP-1529r yang dapat mengamplifikasi gen Nucleoprotein (NP) dari semua virus influenza dari unggas, manusia, babi dan kuda serta menggunakan 15 pasang primer HI-15 yang dapat mengamplifikasi gen Hemagglutinin (HA) dari subtipe virus avian influenza. Hasil RT-PCR memperlihatkan kedua gen dari virus isolat Legok tersebut dapat teramplifikasi menggunakan pasangan primer NP-1200f dan NP-1529r, dan dengan pasangan primer H5-131f dan H5-580r. Hasil ini menunjukkan bahwa isolat Legok termasuk virus AI subtipe H5N I.

Kata kunci: Avian influenza, RT-PCR, Nucleoprotein, Hemagglutinin, isolat Legok

PENDAHULUAN

Avian influenza (AI) adalah penyakit sangat menular disebabkan oleh virus influenza tipe A, termasuk dalam famili Orthomyxoviridae (Lamb and Krug, 1996). Virus avian influenza dibagi menjadi 15 subtipe HA (H1-H15) dan 9 subtipe NA (N1-N9) (Rohm et al., 1996). Diantara 15 subtipe HA, hanya H5 dan H7 yang tergolong sangat virulen pada unggas. Perbedaan asam amino di antara subtipe HA tersebut sebesar 20%-74%, sedangkan perbedaan asam amino dalam subtipe HA yang sama hanya 0%-9% (Air, 1981). Berdasarkan perbedaan asam amino ini, Lee, et al. (2001) telah merancang primer yang digunakan dalam RT-PCR untuk identifikasi cepat subtipe HA virus avian influenza.

Pada bulan Oktober 2003 telah diisolasi pertama kali di Indonesia virus AI dari ayam layer di Legok Tangerang dengan gejala kelainan pada saluran pernapasan. Untuk mengetahui subtipe virus avian influenza tersebut dilakukan identifikasi dengan metoda RT-PCR menggunakan 15 pasang primer yang ditargetkan pada gen Hemagglutinin (HA) virus. Dari hasil identifikasi ini dapat dilaporkan bahwa cDNA dari isolat tersebut teramplifikasi dengan menggunakan sepasang primer khusus subtipe H5N1.

BAHAN DAN METODA

1. Isolat Virus
Spesimen isolat virus yang diidentifikasi merupakan isolat virus AI strain Legok dalam cairan allantois yang diperoleh dari laboratorium virologi Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan (BBPMSOH).

2. Ekstraksi RNA virus berasal dari cairan allantois
RNA diekstraksi menggunakan TRIZOLLSREAGENT (INVITROGEN). Prosedur secara singkat sebagai berikut, 250 µl suspensi virus isolat dicampur dengan 750 µl trizol dalam micro tube hingga rata. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu kamar (25-30°C) selama 5 menit untuk memisahkan nucleoprotein. Setelah ditambahkan dengan 200 µl chloroform, campuran dikocok dengan tangan selama 15 detik, kemudian diinkubasikan pada suhu kamar selama 10 menit. Campuran dipusing 12.000 rpm pada suhu 2-8°C selama 15 menit. Lima ratus µl fase cair pada supernatan dipindahkan ke microtube baru. Selanjutnya ditambahkan dengan 500 µl isoprophil alkohol. Kemudian disimpan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah dipusing 12.000 rpm pada suhu 2 - 8°C selama 10 menit supernatannya dibuang. Endapan RNA dicuci dengan 1.000 µl ethanol 75% dan dipusing 12.000 rpm suhu 2 - 8 C selama 5 menit. RNA dikeringkan selama 7 menit dan dilarutkan dengan 10 µl air suling bebas RNAse.

3. Pembuatan cDNA
Pembuatan cDNA menggunakan metoda SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Prosedur ringkasnya adalah sebagai berikut, ke dalam 0,5 ml microtube dibuat campuran RNA/primer yang berisi 3 µl RNA contoh, 1 µl 10 mM dNTP mix, 1 µl antisense primer, 5 µl air suling bebas RNase. Campuran ini dipanaskan pada suhu 65°C selama 5 menit, kemudian didinginkan di atas es sekurang - kurangnya selama 1 menit. Pada saat pemanasan campuran diatas, disiapkan pula 9 µl pereaksi yang terdiri dari 2 µl 10X RT buffer, 4 µl 25 mM MgC12, 0,2 µl 0,1 M DTT dan 1 µl RNaseOut (RNase inhibitor). Campuran RNA/primer dicampur dengan pereaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 42°C selama 2 menit. Satu µl SuperScript II RT ditambahkan ke dalam campuran tersebut, dan inkubasi dilanjutkan lagi selama 50 menit. Reaksi ini diakhiri dengan pemanasan 70°C selama 15 menit dan pendinginan di atas es. Kedalam campuran RNA, primer dan pereaksi ditambahkan 1 µl RNAse H dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit.

4. Primer
Untuk identifikasi virus influenza dipergunakan sepasang primer yang dapat mengamplifikasi 329 bp fragmen gen nucleoprotein, NP-1200f [5'CAG(A/G)TACTGGGC(A/T/C)ATAAG(A/G)AC-3] dan NP­1529r [5' -GCATTGTCTCCGAAGAAATAAG-3 ']. Untuk mengidentifikasi subtipe virus avian influenza digunakan 15 pasang primer seperti pada Tabel 1.

5. Amplifikasi cDNA
Amplifikasi cDNA dilakukan berdasarkan metoda Super Script First-Stand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Amplifikasi cDNA dilakukan dalam 50 µl campuran reaksi yang mengandung 5 µl 10X PCR reaction buffer tanpa Mg, 1,5 µl 50 mM MgC12, 1 µl 10 mM dNTP mix, 0,5 µl 50 µM primer (forward), 50 µM primer (reverse), 0,4 µl (2 unit) Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen), 2 fl1 cDNA dan 38,1 µl air suling yang telah diautoclave. Amplifikasi cDNA dilakukan menggunakan Astec Program temperature control system PC-800, dengan urutan perputaran suhu, 95°C selama 3 menit (denaturasi awal) , 35 kali putaran 95°C selama 30 detik (denaturasi), 50°C selama 40 detik (annealing), noc selama 40 detik (ekstensi), dan diakhiri dengan ekstensi noc selama 10 menit.

6. Elektroforesis
Hasil RT-PCR dielektroforesis menggunakan Mupid-2 pada 2% agarose (Promega) dengan running buffer TBE selama 60 menit. Band DNA diwarnai dengan ethidium bromide, dan gambarnya didokumentasikan menggunakan kamera digital (Fuji FinePix, A202).

HASIL DAN PEMBAHASAN

cDNA yang dipero1eh dari isolat virus AI dari Legok, Tangerang dapat menghasilkan band gen Nucleoprotein sekitar 330 bp pada RT-PCR menggunakan primer pasangan NP1200f dan NP1529r (Tabel 2). Pasangan primer tersebut dapat mengamplifikasi gen Nucleoprotein yang berasal dari virus influenza yang berasal dari unggas, babi dan kuda (Altmuller et al., 1989; Gorman et al., 1990; Shu et al., 1993; Lee et al., 2001). Pada elektroforesis, contoh sampel dari virus AI isolat Legok dapat menghasilkan band DNA tersebut berarti gen Nucleoproteinnya dapat teramplifikasi. Hal ini menunjukkan bahwa virus isolat Legok benar sebagai virus influenza.

Untuk mendukung hasil RT-PCR menggunakan primer umum virus influenza, cDNA isolat Legok juga diuji menggunakan 15 primer HA yang dapat digunakan untuk deteksi subtipe HA virus avian influenza. Terdapat satu pasang primer yang dapat mengamplifikasi gen hemagglutinin virus tersebut yaitu pasangan primer H5­-131f dan H5-580r (Tabel 2), produk PCR yang dihasilkan sekitar 450 bp. Hal ini menunjukkan bahwa virus AI isolat Legok yang diidentifikasi virus avian influenza merupakan subtipe H5N1.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terimakasih ditujukan kepada Antonius dan Ratnawati atas bantuan reagen serta kepada Deden Amijaya atas bantuan pengambilan gambar menggunakan digital kamera.

DAFTAR PUSTAKA

Air, G.M. 1981. Sequence relationship among the hemagglutination gene of 12 subtype of influenza a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,7639-7643.

Altmuller, A., W.M. Fitch, C. Scholtissek. 1989.
Biological and genetic evolution of the nucleoprotein gene of human influenza A viruses. 1. Gen. Virol. 70, 2111 - 2119.

Gorman, O.T., W.J. Bean, Y. Kawaoka, W.G. Webster. 1990. Evolution of the nucleoprotein gene of influenza A virus. 1. Virol. 64.1487 -1497.

Lamb, R.A., R. M. Krug. 1996. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication. In: B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, R.M. Chanoek, J.L. Melnick, T.P. Momath, B. Roizman Teds.), Field Virology, 3rd ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, PA.

Lee, M.S., P.C. Chang, J.H. Shien, M.C. Cheng, H.K.
Shieh. 2001. Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR. J. Virol. Met. 97, 13-32.

Rohm, c., N. Zhou, J. Suss, J. Mackenzie, R. G.
Webster. 1996. Characterization of a novel influenza hemagglutinin, H15: criteria for determination of influenza A subtypes. Virology 15, 508 -516.

Shu, L.L., W.J. Bean, R.G. Webster. 1993. Analysis of the evolution and variation of the human influenza A virus nucleoprotein gene from 1933 to 1990. J. Virol. 67,2723-2729.

Sumber : Buletin Pengujian Mutu Obat Hewan no. 10 tahun 2004.

Rating: 5 Reviewer: Info Petani - ItemReviewed: Identifikasi Subtipe Virus Avian Influenza Isolat Legok Menggunakan Polymerase Chain Reaction - 9756people
Info Petani -

Pupuk Organik (Kompos)

Menurunnya kandungan bahan organik tanah ditengarai disebabkan karena cara budidaya pertanian yang kurang memperhatikan kandungan bahan organik. Salah satunya penggunaan pupuk kimia yang sangat intensif. Petani lebih memperhatikan penambahan unsur hara kimia dan tidak memperhatikan bahan organik. Misalnya: petani memakai urea, tetapi selalu membakar jerami setelah panen.


Salah satu akibat dari

Rating: 5 Reviewer: Info Petani - ItemReviewed: Pupuk Organik (Kompos) - 9756people
Info Petani -

Teh Alami dari Kaki Gunung Slamet

Secangkir teh di pagi hari mungkin menjadi kebiasaan kita sebelum berangkat aktivitas. Umumnya teh yang kita minum baik itu dalam bentuk teh celup atau teh tubruk hasil produksi pabrik teh yang ada. Dengan rasa umum kebanyak teh dipasar.

Belum lama ini ketika saya berkunjung seorang sahabat di daerah kaki gunung Slamet, Baturaden-Banyumas. Saya berkesempatan menikmati aroma dan rasa yang unik berbeda dari aroma dan rasa teh pada umumnya. Campuran dari sepet dan sedikit aroma seperti kopi tercampur di teh ini menghasilkan rasa nikmat yang menyegarkan otak kita. Rasa ingin tahu saya pun muncul, menurut kawan saya ini Teh tersebut biasa dinamakan dengan nama "Teh Jawa".

Teh Jawa, teh tradisional dengan full penangannya secara manual tanpa sedikitpun bantuan alat mesin pabrik umumnya pabrik teh. Jika pada pabrik-pabrik teh, setiap daun teh yang dipanen dari kebun akan melewati Proses Pelayuan, Proses Pendinginan dan Proses Penggulungan daun (untuk Teh Hijau), Proses pengeringan dan sortasi. Pada "teh Jawa" ini, petani umumnya memetik daun teh dari kebun teh mereka sendiri kemudian melalui proses pelayuan setelah itu langsung di "Sangan"(sangrai-red). Setelah dingin langsung di pasarkan di pasar-pasar tradisional tanpa kemasan khusus, Jika musim kemarau per kilogramnya bisa mencapai Rp. 20.000,- namun jika musim hujan seperti saat ini harganya dibawah Rp 20.000,-

Sebuah khasanah kuliner Asli Indonesia dengan nilai-nilai tradisional yang masih tinggi, Jika kita kelola dengan baik tentunya akan lestari dan menambah nilai tambah bagi peningkatan kesejahteraan para petani.

Rating: 5 Reviewer: Info Petani - ItemReviewed: Teh Alami dari Kaki Gunung Slamet - 9756people
Info Petani -

CPNS PENYULUH PERTANIAN BAGI THL TBPP ANGKATAN I TAHUN 2007

PENGUMUMAN

MODUS BANTUAN MENJADI CPNS PENYULUH PERTANIAN

BAGI THL-TBPP ANGKATAN I TAHUN 2007

NOMOR : 278/TU.220/J.4/22/2009

Sehubungan banyaknya informasi yang beredar ditengah masyarakat dari seseorang yang mengatasnamakan diri sebagai Pegawai Departemen Pertanian dan atau sebagai Pejabat tertentu di lingkungan Badan Pengembangan SDM Pertanian, Departemen  Pertanian dengan meminta imbalan sejumlah uang yang seolah-olah bisa membantu dalam proses kelulusan CPNS Penyuluh Pertanian tahun 2009, maka dengan ini

diberitahukan hal-hal sebagai berikut :

1. Bahwa secara tegas Kepala Badan Pengembangan SDM Pertanian, Departemen Pertanian menyatakan informasi tersebut tidak benar.

2. Apabila ada pihak-pihak yang mengaku dan mengatasnamakan diri sebagai Pejabat dilingkungan Badan Pengembangan SDM Pertanian, Departemen Pertanian untuk membantu dan menjanjikan bisa memperjuangkan THL-TBPP Angkatan I Tahun 2007 diterima menjadi CPNS Penyuluh Pertanian dengan meminta imbalan sejumlah uang melalui telepon, fax, surat via pos, atau lisan, agar tidak menanggapi seluruh informasi yang disampaikan dengan alasan apapun, dan pihak Badan Pengembangan SDM

Pertanian, Departemen Pertanian tidak bertanggungjawab.

3. Diharapkan dukungan seluruh pihak yang mengetahui keberadaan oknum atau siapapun pelakunya, agar segera melaporkan dengan disertai bukti-bukti otentik yang dapat dipertanggungjawabkan baik secara yuridis maupun administratif ke Posko THL-TBPP melalui Tlp. 021-98273723 Fax. 021-7804386 atau kepada Pihak Yang Berwajib (Kepolisian) atas tuduhan penipuan.

4. Untuk kemudahan mengakses informasi pengumuman terkait dengan pembaharuan kontrak kerja THL-TBPP angkatan I Tahun 2007 melalui alamat sebagai berikut: http://www.deptan.go.id

Jakarta, 22 Desember 2009
Kepala Pusat Pemgembangan Penyuluhan
Pertanian
TTD
DR. Ir. MEI ROCHJAT DARMAWIREDJA, M.Ed
NIP.195605011980031004

(www.deptan.go.id)

Rating: 5 Reviewer: Info Petani - ItemReviewed: CPNS PENYULUH PERTANIAN BAGI THL TBPP ANGKATAN I TAHUN 2007 - 9756people
Info Petani -

HASIL PERTANIAN YANG SEMAKIN MEMPRIHATINKAN

Hasil pertanian dunia saat ini sangat memprihatinkan. Kebutuhan akan pangan dunia dalam kondisi kritis, ini ditunjukkan dengan meningkatnya pertumbuhan manusia yang begitu pesat yang tidak diimbangi dengan peningkatan hasil pertanian. Cara yang paling banyak dilakukan dalam tiga dasawarsa terakhir yaitu dengan revolusi hijau tidak mampu memenuhi kebutuhan pangan dunia. Hasil pertanian yang kurang memuaskan dan akibat yang ditimbulkan begitu besar, yang terparah adalah rusaknya lingkungan dan kemunduran kualitas alam.

Dengan pengalaman kelam tersebut maka sebagian masyarakat meningkatkan hasil pertaniannya dengan cara bertani secara organik. Trend masyarakat dunia untuk kembali ke alam (back to nature) telah menyebabkan permintaan produk pertanian organik di seluruh dunia tumbuh pesat sekitar 20% per tahun. Sehingga diperkirakan pada tahun 2010 pangsa pasar dunia terhadap produk pertanian organik akan mencapai U$ 100 milyar (Ditjen BPPHP
Deptan, 2001).

HAsil pertanian organik dapat dilakukan dengan sistem manajemen produksi terpadu yang menghindari penggunaan pupuk buatan, pestisida dan hasil rekayasa genetik, menekan pencemaran udara, tanah, dan air. Dengan kata lain, sistem produksi pertanian yang holistik dan terpadu, dengan cara mengoptimalkan kesehatan dan produktivitas agroekosistem
secara alami, sehingga menghasilkan pangan dan serat yang cukup, berkualitas, dan berkelanjutan. Di sisi lain, pertanian organik meningkatkan kesehatan dan produktivitas di antara flora, fauna dan manusia. Penggunaan masukan di luar pertanian yang menyebabkan degradasi sumber daya alam tidak dapat dikategorikan sebagai pertanian organik. Sebailknya, sistem pertanian yang tidak menggunakan masukan dari luar, namun mengikuti aturan pertanian organik dapat masuk dalam kelompok pertanian organik, meskipun agro-ekosistemnya tidak mendapat sertifikasi organik.

Untuk menjadikan Indonesia sebagai salah satu negara penghasil produk pangan organik yang
dapat mengisi pasar dunia, Departemen Pertanian telah mencanangkan program “Go Organic 2010”. Standar Nasional Indonesia tentang Sistem Pangan Organik telah tersusun dalam SNI 01-6729-2002 yang berisi panduan tentang cara-cara budidaya pangan organik (tanaman pangan dan ternak), pengemasan, pelabelan dan sertifikasinya.

Rating: 5 Reviewer: Info Petani - ItemReviewed: HASIL PERTANIAN YANG SEMAKIN MEMPRIHATINKAN - 9756people
Info Petani -